液压撞击伤后神经元内游离氢的变化及其影响因素张相彤刘恩重刘晓谦苏君武俏丽戴钦舜] i）的变化，探讨尼莫地平（Nim）、D2 氨基戊酸（DAP5）和亚低温对创伤后神经元内[ H ] i变化的影响及机制。方法以BCECF AM为细胞内氢离子的荧光指示剂，用激光共聚焦显微镜测定液压撞击伤时体外培养的大鼠神经元内[ H ] i的变化。结果液压撞击伤后脑皮质神经元[ H ] i于伤后于伤后4 h内应用可降低[ H ] i，而DAP5于伤后10 h之内应用有效，亚低温于30 min内应用可降低细胞内[ H ] i的效果优于Nim（P 0 .001）。结论液压撞击伤致神经元内酸中毒， Nim、DAP5和亚低温均降低细胞内] i，但各自作用的有效时间窗不同，揭示对创伤后神经元酸中毒应注意综合治疗，并选定各自作用的最佳时间窗。

　　作者单位：150001哈尔滨医科大学第一附属医院神经外科（张相彤现在北京市神经外科研究所病理生理研究室，100050）脑创伤是当今青少年致死致残的重要原因之一。脑创伤后的神经组织损伤除原发机械损伤外，其所继发的病理损害更为引人注目。这些继发的病理损害与脑创伤后神经生化反应密切相关，其中包括细胞内酸中毒。了解创伤后神经细胞内酸中毒形成机制，对创伤预后改善有着重要意义。笔者着重研究尼莫地平（Nim）、D 2 氨基戊酸（D AP 5）和亚低温对创伤后神经元细胞内[ H ] i的影响，并分析其可能作用机制。

　　材料与方法1.细胞培养：取新生Wistar大鼠104只大脑皮层组织，分散成单细胞悬液，接种于50 ml培养瓶中的预先洗涤有多聚赖氨酸（美国Sigma公司）的盖玻片上，送入含体积分数为培养箱37℃培养，培养液为含有体积分数为10 的胎牛血清的RPMI1640.经8～14 d的原代培养后进行研究。神经元烯醇化酶（NSE）免疫组化染色显示40阳性，胶质细胞纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组化染色显示60阳性。

　　2 .液压撞击伤实验：液压撞击伤装置参考Scott等模型，冲击压力为2 .5kPa，作用时间为20～30 ms.

　　3 .实验分组：（1）正常对照组。（2）创伤组：又分为创伤治疗，观察2 h后对细胞内[ H ] i的影响。以上各实验组鼠数均为8只。

　　4 .神经元内[ H ] i的测定：在盖玻片上培养的神经元，经磷酸缓冲液（PBS）冲洗3次后，于37℃条件下用小室上，用Insight plusIQ激光共聚焦显微镜488 nm氩离子激光激发，记录530 640 nm发射荧光，求二者之比。根据标准曲线求出细胞内pH值。

　　直接标定细胞内pH值求标准曲线：配制高钾缓冲液，nm）细胞内BCECF的激发荧光比值，求出该比值与pH值的标准曲线。

　　5 .统计学处理：结果采用SAS软件系统处理，以x±s表示，组间比较采用双样本异方差t检验进行统计学分析。

　　结果1 .液压撞击伤后神经元内[ H ] i的变化：与正常对照组相比较，伤后0 .25 h神经元内[ H ] i即已逐渐升高，于伤后12 h达高峰，随后[ H ] i逐渐下] i的变化2 .Nim、D AP 5和亚低温对液压撞击伤后神经元内[ H ] i变化的影响：Nim治疗组于伤后4 h内应用可抑制细胞内[ H以上应用则无效（P 0 .05）。D AP 5治疗组于伤后4 h内应用明显抑制[ H以上则无效（P 0 .05）。亚低温治疗组在伤后0 .5 h内可降低[ H细胞内[ H见图2.

　　] i的影响讨论酸中毒是颅脑创伤继发性病理损害过程的一个重要方面。因此，直接检测细胞内[ H ] i是深入探讨脑创伤时神经生化变化的重要手段之一。以往的研究主要采用生化分析血浆中乳酸含量或采用微透析技术监测脑组织细胞外液中乳酸含量等方法间接反应脑组织酸中毒。笔者采用细胞内H荧光探针BCECF AM直接检测脑液压撞击伤后不同时间单个神经元胞浆中[ H ] i水平的变化，发现脑创伤后神经元存在酸中毒。伤后0 .25 h细胞内[ H ] i即已升高，并于12 h达高峰，以后逐渐下降，48 h仍维持较高水平。这种脑创伤后神经元胞体[ H ] i升高的原因尚未完全明确，可能与以下两方面有关：（1）脑创伤后神经元内K大量外流，从而导致细胞膜去极化，而这种去极化又可诱导兴奋性氨基酸（EAA）的释放，而进一步促进K外流，同时Ca内流，这样在离子跨膜异常与EAA释放之间形成一种恶性循环。神经元为了维持细胞内外正常离子平衡，这种异常跨膜离子障碍激活能量依赖性离子泵及刺激ATP水解增加，最终使糖酵解增强，结果导致乳酸堆积，细胞内酸中毒形成。（2）脑创伤后γ氨基丁酸（GABA）释放可激活Cl通道，从而使HCO外流同时谷氨酸释放激活N 甲基D 天门氡氨酸（NMDA）受体，从而H内流，这样形成细胞外液短暂碱性化。这种细胞外液短暂碱性化、细胞内H升高及膜去极化均可激活Na交换泵。此外，脑创伤后与EAA受体耦联的蛋白激酶C（PKC）也可被激活，从而使Na交换泵磷酸化而激活交换泵间接依赖Na泵直接依赖于Na ATP大量消耗，一方面产生H，另一方面刺激无氧糖酵解增强，最终产生乳酸堆积，细胞内酸中毒。可见EAA受体的激活和Na泵与Na泵的激活是乳酸堆积的一个重要来源。

　　脑创伤后神经元细胞膜去极化，电压依赖性钙通道开放，而尼莫地平特异性阻断该通道开放，从而减轻跨膜Ca异常分布，进而减少Ca泵对ATP的消耗，最终使H产生减少及糖酵解作用减弱。此] i竞争细胞内蛋白结合位点，内流减少从而使[ H ] i减少。本实验结果显示，尼莫地平于创伤后4 h内应用有效，10 h以上则无效。这说明脑创伤后早期Ca内流很可能以电压依赖性通道为主，而晚期可能以受体依赖性通道激活的NMDA受体数目减少，从而减少Ca内流及K外流，恢复跨膜离子异常紊乱降低糖酵解，进而减少[ H ] i的升高。笔者采用NMDA受体竞争性拮抗剂D AP 5 ，在创伤后4 h内应用最佳，4～10 h内应用效果欠佳， 22 h以上应用则无效。这说明EAA释放主要在伤后10 h内，而10 h以上一方面由于EAA释放减少，另一方面由于其他生化级联反应（如花生四烯酸等）形成有机酸增多，并且细胞内Ca超载、自由基形成、酸中毒等相互影响，最终使创伤后期酸中毒形成不单一局限于EAA受体所介导的离子紊乱这一因素。亚低温治疗保护作用主要通过以下几方面降低[ H制EAA释放（2）减少ATP消耗[ 8]，从而一方面减少H生成，另一方面减少刺激糖酵解增强（3）抑制PKC的活性[ 9]，从而使PKC磷酸化G 蛋白受体抑制，进而控制Na内流，减轻跨膜离子紊乱，最终使糖酵解减弱。笔者观察亚低温治疗组伤后0 .5h内应用有效，而1 h以上应用则无效。其原因可能是伤后1 h以上，EAA释放增多，而且PKC已被激活，ATP消耗增加，最终导致亚低温伤后1 h以上应用无效。

　　本实验结果表明，Nim、D AP 5和亚低温从不同机制保护创伤后神经元，且有效治疗时间窗不同。提示临床上对创伤后神经元酸中毒应注意综合治疗，并选定各自作用最佳时间窗。本实验建立于细胞水平的创伤模型，至于整体水平上效果如何，还需要进一步研究。